En la primera mitad del siglo XVI se construyó el colegio y sus dependencias más la iglesia.
[8] El obispo fundó mayorazgo que otorgó a su hermano Gregorio Romano.
El patronazgo del colegio de San Ambrosio caería sobre sus herederos sin obtener otros beneficios que no fueran los de entierro y oficios religiosos.
Por su parte los jesuitas se comprometían a construir una iglesia con sacristía con retablo mayor y con reja.
[10] San Ambrosio fue un centro educativo y estuvo siempre muy cercano a la docencia de la Universidad.
El edificio de los Estudios (que fue la parte más moderna de todo el complejo) tuvo una nueva fachada donde se colocaron las estatuas de San Ambrosio y del santo jesuita Luis Gonzaga, todo obra del escultor y tallista vallisoletano Pedro Bahamonde.
[11] De ello hace mención el ensamblador y diarista Ventura Pérez:
[13] En 1769 se reabrieron con carácter civil los Estudios Generales dedicados a Gramática, Retórica y Primeras Letras (leer y escribir),[14][15] pero la Universidad siempre tuvo mucho interés por el edificio hasta que el 14 de septiembre de 1789 consiguió tomar posesión.
[14] En 1775, la iglesia del colegio de San Ambrosio se utilizó como parroquia consagrada a San Esteban; se quitaron los emblemas de la Compañía sustituyéndolos por el escudo real.