El Cuarto de la Reina se formó en el marco de las reformas emprendidas por Carlos I que llevaron a la ampliación del primitivo Alcázar, ya ampliado por los Trastámara, hacia el este formando un nuevo patio cuadrado, rodeado por crujías en todos sus lados.
El cuarto de la Reina se localizaba en el piso principal alrededor del patio homónimo.
En concreto, en la mitad sur de la crujía oeste y la crujía sur, hasta aproximadamente la mitad del edificio marcado por la capilla.
Siguiendo la distribución descrita por Juan Gómez de Mora, y que acompaña al plano homónimo realizado en 1625, sus estancias serían las siguientes (siguiendo la numeración del Plano de Mora: 41.
Así mismo, desde la década de 1620 la reina contaba con un apartamento de verano situado en el piso bajo (cuarto bajo) y en el inmediatamente inferior a este (bóvedas).
A continuación de este, se encontraba el cuarto bajo del Rey, con fines muy similares.