Luego debió acompañar a Pedro de Alvarado en su avance hacia el sur por la costa del Pacífico.
Ante la férrea oposición de la población autóctona, Pedro de Alvarado tuvo que retirarse a Guatemala, y en 1525 lanzó una segunda expedición, mejor organizada, que acabó por conquistar todo el territorio.
En 1534 Diego se alistó en la expedición que organizó Pedro de Alvarado con destino al Perú.
Allí les salió al encuentro Diego de Almagro y sus hombres, dispuestos a cerrarles el paso.
Simultáneamente, participó en la pacificación de la región de Quito: apresó al capitán inca Zozocopahua, que se había hecho fuerte en los Sichos y luego intervino en las operaciones militares contra los generales atahualpistas Quisquis y Rumiñahui.
Pedro de Alvarado negoció con Almagro, y tras largas discusiones aceptó cederle su ejército y navíos a cambio de 100,000 pesos; luego bajó al valle del Rímac y Pachacámac (costa central del Perú), con el propósito de conocer el país, aunque no lo dejaron ir al Cuzco, como era su deseo.
Acompañó a Almagro al Cuzco, convirtiéndose desde entonces en su leal servidor y hombre de confianza.
Tomado el Cuzco y encarcelados los hermanos Hernando y Gonzalo, Diego de Alvarado impidió que Rodrigo Orgóñez matara a Hernando Pizarro, pues consideraba que un acto como ese ocasionaría una ruptura irreconciliable con Francisco Pizarro.
Se alistó para embarcarse rumbo a España, con el propósito de presentar ante la Corona una queja contra los hermanos Pizarro.
Por coincidencia, por esos días arribó Hernando Pizarro a España llevando el Quinto real.
Pero los trajines propios de un proceso judicial de tal envergadura abrumaron tanto a Diego de Alvarado hasta el punto de dirigirse a Hernando ofreciéndole diferirlo, con tal que los dos saliesen a un campo donde ventilarían el pleito con sus espadas, y él le probaría, a ley de caballero, que había faltado al juramento hecho cuando le puso en libertad Almagro; que habían sido ingratos él y su hermano Francisco al hacer morir a Almagro; y que en todas sus obras habían desobedecido las órdenes del Rey.