CRISPR/Cas
Se han desarrollado nuevas variantes de la nucleasa Cas9 que reducen significativamente la actividad fuera del objetivo.
[17] Las CRISPR también puede dirigirse a varios sitios de ADN simultáneamente simplemente introduciendo diferentes ARN guías (ARNg).
Los tomates se modificaron genéticamente para obtener una cantidad de GABA cinco veces superior a la normal.
[13][14] En diciembre de 2023, la FDA aprobó la primera terapia génica en Estados Unidos para tratar a pacientes con anemia falciforme (ECF).
[60] Este ARNgu puede incluirse junto con el gen que codifica la proteína Cas9 y hacerse en un plásmido para ser transfectado en las células.
[61][62] Las proteínas alternativas a Cas9 incluyen las siguientes: Las CRISPR-Cas9 ofrecen un alto grado de fidelidad y una construcción relativamente simple.
Sin embargo, esto no es demasiado limitante, ya que generalmente es una secuencia muy corta y no específica que ocurre frecuentemente en muchos lugares a lo largo del genoma (por ejemplo, la secuencia PAM de SpCas9 es 5'-NGG-3' y en el genoma humano ocurre aproximadamente cada 8 a 12 pares de bases).
La electroporación de ADN, ARN o ribonucleocomplejos es una técnica común, aunque puede resultar en efectos dañinos para las células objetivo.
[80] También se han utilizado técnicas de transfección química que emplean lípidos y péptidos para introducir ARNgus en complejo con Cas9 en las células.
[93][94] Se ha demostrado que los ARNgu truncados iterativamente y los ARNg altamente estabilizados también disminuyen los efectos fuera del objetivo.
[107] Los métodos para controlar la edición del genoma con pequeñas moléculas incluyen un Cas9 alostérico, sin edición de fondo detectable, que activará la unión y la escisión tras la adición de 4-hidroxitamoxifeno (4-HT),[99] inteína fusionada con Cas9 sensible a 4-HT,[108] o un Cas9 que es sensible a 4-HT cuando se fusiona con cuatro dominios ERT2.
El control espacio-temporal es una forma de eliminar los efectos fuera del objetivo: solo ciertas células o partes del organismo pueden necesitar ser modificadas, y por lo tanto, la luz o las pequeñas moléculas pueden usarse como una forma de llevar esto a cabo.
[124] Simplemente cambiando la secuencia del ARNg, la Cas9-endonucleasa puede llegar a un gen de interés e inducir DSBs.
[135] La edición exitosa del genoma in vivo utilizando CRISPR-Cas9 se ha demostrado en numerosos organismos modelo, incluidos Escherichia coli,[136] Saccharomyces cerevisiae,[137][138] Candida albicans, Methanosarcina acetivorans,[139][140] Caenorhabditis elegans,[141] Arabidopsis spp.,[142] Danio rerio[143] y Mus musculus.
[154] Estas células madre pluripotentes modificadas con las CRISPR fueron posteriormente cultivadas en organoides renales humanos que mostraron fenotipos específicos de la enfermedad.
[154] Se tomó un enfoque similar para modelar el síndrome del QT largo en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes.
[157] Estos modelos celulares generados por las CRISPR, con controles isogénicos, proporcionan una nueva forma de estudiar enfermedades humanas y probar medicamentos.
[171] Las CRISPR también se han utilizado para curar la malaria en mosquitos, lo que podría eliminar el vector y la enfermedad en los humanos.
[173] Además, los ensayos clínicos para curar la beta talasemia y la enfermedad de células falciformes en pacientes humanos utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 han mostrado resultados prometedores.
Esta tecnología representa así una forma novedosa de terapia antimicrobiana y una estrategia para manipular poblaciones bacterianas.
[192][193] Estudios recientes sugieren una correlación entre la interferencia del locus CRISPR-Cas y la adquisición de resistencia a antibióticos.
[194] Este sistema proporciona protección a las bacterias contra el ADN extraño invasor, como transposones, bacteriófagos y plásmidos.
[202] Pueden descubrir los mecanismos moleculares que contribuyen a estos trastornos, lo cual es esencial para desarrollar tratamientos efectivos.
Las CRISPR-Cas9 se pueden utilizar para investigar e identificar las diferencias genéticas entre los humanos y otros simios, especialmente del cerebro.
Su ARN guía se dirige a secuencias de ADN regulatorias llamadas promotores que preceden inmediatamente al gen objetivo.
La técnica logró un fuerte efecto al dirigir múltiples construcciones de CRISPR a ubicaciones ligeramente diferentes en el promotor del gen.
[247][248] El estudio había sido rechazado previamente tanto por Nature como por Science, en parte debido a preocupaciones éticas.
La alteración de gametocitos y embriones para generar cambios heredables en los humanos se definió como irresponsable.
El grupo acordó iniciar un foro internacional para abordar tales preocupaciones y armonizar regulaciones en todos los países.
[255] En los Estados Unidos, existe un sistema regulador interdepartamental elaborado para evaluar nuevos alimentos y cultivos modificados genéticamente.
