Nació en la ciudad de Florencia, siendo la segunda hija del gran duque Fernando I de Médici, y de Cristina de Lorena.
Fue hermana, entre otros, de Cosme II de Médici; Catalina de Médici, casada con Fernando I Gonzaga de Mantua; y Claudia de Médici, casada sucesivamente con Federico Ubaldo della Rovere y Leopoldo V de Habsburgo.
Para establecer una gran alianza con la monarquía católica española, fue propuesta en 1611 en matrimonio al rey Felipe III de España tras la muerte de su primera esposa, Margarita de Austria-Estiria, si bien el rey español rehusó volverse a casar.
Leonor la cual tuvo una salud delicada toda su vida, murió a la edad de veintiséis años, a causa de la viruela.
Su cuerpo descansa en la Capilla de los Médici en la Basílica de San Lorenzo.