Era el tercer hijo de Henri Estienne el Viejo y, cuando este falleció, allegó como padrastro a su socio impresor, Simon de Colines, que se casó con la viuda.
En osteología se dio cuenta del papel fisiológico que desempeñaban los poros de los huesos.
En 1539 fue el primero en citar las válvulas venosas del hígado en su libro De Dissectione Partium Corporis Humani Libri Tres (impreso en 1545); en 1751, Albrecht von Haller (1708-1777) le confirió esa primacía (primus auctor valvularum), si bien estas válvulas venosas son tan difíciles de observar que la historia registró a otro personaje como su descubridor, Girolamo Fabrizi Acquapendente (1537-1619).
Como resultado de deudas surgidas por negocios ruinosos, Estienne se vio obligado a establecerse en Châtelet en 1561 y allí falleció en 1564.
Charles Estienne compuso varios diccionarios y numerosas otras obras.