FPIA, al igual que todos los inmunoensayos se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos de unirse con alta afinidad y especificidad a un determinado antígeno esta propiedad es utilizada para reconocer específicamente al analito de interés, y por medio de diferentes mecanismos, generar una señal que puede ser medida.
En el caso de FPIA, la señal que se mide es luz fluorescente polarizada.
En los ensayos competitivos por lo tanto la señal producida es inversamente proporcional al analito presente en la muestra (A menor cantidad de analito, mayor es la señal y viceversa); esta propiedad permite cuantificar con facilidad muy pequeñas cantidades y variaciones en la concentración de un analito.
3) Emisión: El electrón excitado en estado vibracional bajo disipa esa energía en forma de un cuanto de luz, hasta adquirir un estado energético basal en un estado vibracional alto.
Aunque el proceso de fluorescencia se caracteriza por tener tiempos muy cortos, (los tres pasos se realizan en tiempos que van entre los micro y nanosegundos), lo cierto es que no es instantáneo.
Esto puede ser comprobado al iluminar una solución de una sustancia fluorescente con luz polarizada, los electrones que se excitan reciben luz en un plano particular de polarización, mientras que los electrones excitados que decaen, emiten luz también en un plano particular de polarización.
Debido a que la energía cinética promedio de todas las moléculas en un sistema a una determinada temperatura es la misma, y a que esta energía depende de la masa que posee la molécula, se puede deducir que si las moléculas en solución son pequeñas, se mueven a una gran velocidad; mientras que si son grandes, para conservar la misma energía deben moverse lentamente (otra expresión de esto es la Ley de Graham).
Si una molécula fluorescente es pequeña, puede girar rápidamente sobre sí misma, por lo que al iluminar la solución fluorescente con luz polarizada la luz emitida contiene numerosos planos de polarización al azar, es decir es no polarizada.
Si estas moléculas no se mueven, la luz emitida, poseerá también un rango particular de ángulos de polarización con respecto a la luz aplicada.
Esta anisotropía intrínseca denotada como r0) se mide usualmente embutiendo al fluoróforo en un poliol congelado.
[1] Este análisis es válido únicamente si los fluoróforos se encuentran relativamente alejados unos de otros.
En FPIA la molécula competidora marcada es fluorescente y comparativamente pequeña, por lo que presenta altas velocidades de rotación en relación con su tiempo de decaimiento.
El arreglo estructural para la medición en FPIA es muy sencillo, cuenta con una lámpara emisora capaz de generar una buena intensidad en la región corta del espectro (UV-Azul), luego un polarizador que deja pasar sólo la luz polarizada en un determinado plano y un monocromador que permite seleccionar la longitud de onda excitadora; a continuación se encuentra la cubeta transparente que contiene la muestra, después otro polarizador orientado en el mismo plano que el primero,a continuación cuenta con otro monocromador capaz de seleccionar la longitud de onda de emisión del sistema, para finalmente contar con un fotodetector capaz de cuantificar la cantidad de luz recibida.
Debido a la naturaleza de la técnica se encuentra limitada para la cuantificación de moléculas de pequeño tamaño y relativamente bajo peso molecular en solución tales como el ácido valproico, homocisteína, fenobarbital, difenilhidantoína (fenitoína), ciclosporina A, canabinoides tales como el THC, benzodiacepinas, antidepresivos tricíclicos, cocaína, metotrexato, anfetaminas, amikacina, gentamicina, vancomicina, salicilatos, carbamazepina, acetaminofen, everolimus, algunas hormonas tales como la tiroxina y el cortisol, vitaminas tales como el ácido fólico y aminoácidos de importancia clínica tales como la metionina y la homocisteína entre otros.