[4] El mantenimiento epigenómico es un proceso continuo y juega un papel importante en la estabilidad de los genomas eucariotas al participar en mecanismos biológicos cruciales como la reparación del ADN.
[12] Las opiniones clásicas han atribuido la variación fenotípica a diferencias en la estructura primaria del ADN, ya sea a través de una mutación aberrante o de una secuencia alélica heredada.
Las investigaciones han demostrado que las células son capaces de regular la expresión genética en varias etapas: transcripción, procesamiento y transporte del ARNm, así como en la traducción de proteínas, el procesamiento postraduccional y la degradación.
[15] Con el descubrimiento de que la metilación del ADN y las modificaciones de las histonas son procesos estables, hereditarios y también reversibles que influyen en la expresión genética sin alterar la estructura primaria del ADN, se proporcionó un mecanismo para la variabilidad observada en la expresión genética celular.
[16] Estas modificaciones se denominaron epigenéticas, de epi “encima” del material genético “ADN”.
La metilación del ADN y la modificación de histonas se encuentran entre los procesos epigenéticos mejor caracterizados.
Las enzimas encargadas de catalizar esta reacción son las ADN metiltransferasas (DNMT).
No se ha demostrado que algunos organismos como Caenorhabditis elegans tengan 5 mC ni una ADN metiltransferasa convencional; esto sugeriría que también están implicados otros mecanismos además de la metilación del ADN.
Esto contrasta con las regiones promotoras no metiladas que están asociadas con genes expresados activamente.
[20] El mecanismo por el cual la metilación del ADN reprime la expresión genética es un proceso de varios pasos.
Se conocen muchos tipos diferentes de modificación de histonas, que incluyen: acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinación, SUMOilación, ADP-ribosilación, desaminación e isomerización de prolina; la acetilación, metilación, fosforilación y ubiquitinación se han implicado en la activación genética, mientras que la metilación, ubiquitinación, SUMOilación, deiminación e isomerización de prolina se han implicado en la represión genética.
Tenga en cuenta que varios tipos de modificación, incluidas la metilación, la fosforilación y la ubiquitinación, pueden asociarse con diferentes estados transcripcionales dependiendo del aminoácido específico de la histona que se modifica.
En un estado de cromatina suelta, el ADN es más accesible a la maquinaria transcripcional y, por tanto, se activa la expresión.
[23] [26] La epigenómica comparte muchos puntos en común con otros campos de la genómica, tanto en metodología como en su propósito abstracto.
[27] Sin embargo, si bien las modificaciones epigenéticas se conocen y estudian desde hace décadas, es a través de estos avances en la tecnología bioinformática que han permitido análisis a escala global.
En primer lugar, las histonas se entrecruzan con el ADN in vivo mediante un tratamiento químico ligero (por ejemplo, formaldehído).
A continuación, las células se lisan, lo que permite extraer y fragmentar la cromatina, ya sea mediante sonicación o tratamiento con una enzima de restricción no específica (por ejemplo, nucleasa microcócica).
[35] Este método se limitó a no ser adecuado para estudios sobre el patrón de metilación global, o "metiloma".
Podrían surgir más complicaciones cuando la digestión incompleta del ADN mediante enzimas de restricción generara resultados falsos negativos.
Sin embargo, fue el uso de electroforesis en gel bidimensional lo que permitió caracterizarlo a una escala más amplia.
El enfoque WGBS utiliza una plataforma Illumina Genome Analyzer y ya se ha implementado en Arabidopsis thaliana.
Luego, estas secuencias se comparan con un genoma de referencia que permite identificar su posición relativa.
[42] Tanto MNase-seq como DNase-seq siguen los mismos principios, ya que emplean enzimas líticas que se dirigen a los ácidos nucleicos para cortar las hebras de ADN no unidas por nucleosomas u otros factores proteicos, mientras que las piezas unidas están protegidas y pueden recuperarse y analizarse.
Dado que las regiones activas no unidas se destruyen, su detección solo puede ser indirecta, mediante la secuenciación con una técnica de secuenciación de próxima generación y la comparación con una referencia.
Los fragmentos libres y unidos se separan con una extracción tradicional con fenol-cloroformo, ya que la fracción proteica queda atrapada en la interfase, mientras que el ADN no unido pasa a la fase acuosa y puede analizarse con varios métodos.
[47] La sonicación produce roturas aleatorias y, por lo tanto, no está sujeta a ningún tipo de sesgo, y además la mayor longitud de los fragmentos (200-700 nt) hace que esta técnica sea adecuada para regiones más amplias, aunque no puede resolver el nucleosoma único.
La transposasa se utiliza para insertar etiquetas en el genoma, con mayor frecuencia en regiones no cubiertas por factores proteicos.
Luego, las etiquetas se utilizan como adaptadores para PRC u otras herramientas analíticas.
[55] Como referencia se utiliza ADN amplificado que no presentará sitios metilados copiados después del proceso de PCR.
Cuando la enzima encuentra bases químicamente modificadas, se ralentizará o acelerará de una manera únicamente identificable.