Fue un lugar destacado por su importancia ceremonial y las obras de arte que atesoraba.
En esta época la capilla presentaba una estructura muy similar a la que mantendría hasta las reformas ejecutadas en el siglo XVII por Carlos II.
Los muros estaban decorados con yeserías parecidas a las que adornaban el resto del alcázar trastamarino.
Estas obras incluyeron un nuevo patio al este de la capilla, lo que hizo que esta pasara a situarse en el eje central del edificio, ocupando un importante núcleo del nuevo alcázar.
En la separación entre ambos espacios se colocó una rejería decorada con escudos que permitía la visión de la capilla desde la citada sala.
Este espacio cerrado y vitrado, permitía, inicialmente, a la reina seguir las ceremonias litúrgicas de forma más o menos secreta.
Posteriormente, el rey también seguiría las ceremonias litúrgicas en secreto desde este lugar, sin necesidad de salir a la cortina.
A la derecha del cancel se dispuso una pequeña capilla, que permitía que cuando la reina o algún miembro de la familia real estuviera en el cancel pudiera seguir de cerca una misa.
De acuerdo con el gusto de Felipe II, este mandó colocar sobre el altar mayor, en el espacio que tradicionalmente ocuparía el sagrario, una copia realizada por Miguel Coxie del retablo del Cordero Místico.
Al menos desde su reinado se colocaban tapices para decorar la capilla de acuerdo con el tiempo litúrgico correspondiente.
En ella asistía el monarca a los oficios y ceremonias religiosas, se celebraban bautizos y hasta se llevaban a cabo actos de conclusiones, o defensa de tesis.
[Nota 1][8][9][10] Durante toda su existencia la capilla ocupó el mismo espacio físico en el Alcázar.
Tras las reformas de Carlos II, la capilla adquirió un aspecto más acorde con el gusto barroco, con su cúpula encamonada decorada por Lucas Jordán con la historia de Salomón, y figuras alegóricas a la Ley Divina en las pechinas.